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为了尽快帮助中国补充航空作战装备，美国政府决定把原为英国生产的100架“P-40”战斗机提供给中国。与此同时，陈纳德和宋子文则以“中央飞机制造公司”的名义在美国各地招募空地勤人员，并开出丰厚条件：飞行员月薪600美元、队长月薪750美元，机械人员月薪350到400美元不等。此外，飞行员每击落一架日本飞机，额外奖励500美元。根据规定，招募的人员通过签约成为中国空军志愿人员，为中国空军服务，并受到交战国被俘人员的国际保护。
1941年7月，由110名飞行员、150名机械人员和后勤人员组成的第一批美国志愿人员到达缅甸仰光。8月1日，美国航空志愿队在缅甸东吁机场正式成立，陈纳德担任上校队长，下辖3个中队，分别命名为亚当和夏娃中队、熊猫中队、地狱天使中队。当时传闻日本人惧怕鲨鱼，因此航空志愿队的涂装除了机身上的中国空军的标识外，还在机首图绘张着红色血盆大口的鲨鱼，以挫敌志。这成为这支航空志愿队最具特色的涂装，便从此流传，演变为美国航空志愿队的象征之一。
1941年12月20日9时45分，中国空袭警报网发现10架日本轰炸机越过中越边境向昆明飞来。陈纳德接报后，立即意识到：等待已久的时刻终于来临了。当日本轰炸机距昆明还有80余公里时，陈纳德下达作战命令。熊猫中队的一个四机编队去搜索日机，另一个四机编队在昆明上空作防御性巡逻，亚当和夏娃中队的16架飞机则飞向昆明偏西方的高空区待命，等待机会投入战斗。10时50分，所有的飞机都轰鸣着冲上蓝天。陈纳德虽有志亲自参与战斗，但因年过五旬，只得和助手以及翻译官进入机场边的作战掩体内指挥作战。
12月23日，日军航空兵66架轰炸机由8架战斗机护航从泰国的基地起飞，开始对缅甸仰光进行大规模空袭。留在缅甸的地狱天使中队同英国空军共33架战斗机升空迎敌。起飞后不到3分钟，他们便发现日机分2个编队来袭。地狱天使中队和英军战斗机轮番攻击，日机也以严密的机枪火力还击。一时间，空中火网密布，不多时，便有多架日机被击落。此战，志愿队和英军击落日军轰炸机7架、击伤10架，自己损失战斗机6架。日军轰炸机虽然达成了空袭目的，但由于轻敌，且护航战斗机数量明显不足，致使损失大量轰炸机。而首次参战的志愿队飞行员们则在混战中表现出了应有的战术和训练水平。
美国航空志愿队在昆明、仰光等地的胜利，使长期饱受日机狂轰滥炸之苦的中国人民感到欢欣鼓舞。中国各大报纸在头版头条报道了美国航空志愿队的战斗经过。美国的《时代与生活周刊》《芝加哥每日新闻报》《》以及合众社、等媒体也都对美国航空志愿队的非凡战绩进行报道。12月27日，旧金山KGEI电台称美国航空志愿队为世界上最坚强的战斗集体。《柯里尔》杂志发文指出：“在日本人势如破竹地取得胜利的道路上仅有一个障碍，这就是，缅甸人的天空里到处都有鲨鱼。”陈纳德也一下子成为全中国家喻户晓的英雄人物。重庆媒体及民众均以“飞虎添翼”之语称赞志愿队，并由此冠以“飞虎队”的非正式名称。
1942年春天，日本陆、海军在法属印度支那集中了450架飞机，这支力量可随时加强到缅甸战场上，也可南下新加坡，威胁那里的盟军。为了配合盟军在中南半岛的对日作战，中国空军和“飞虎队”并肩作战，主动出击越南境内的日军航空基地。1月22日，“飞虎队”的9架战斗机掩护中国空军的18架轰炸机从云南蒙自出发，袭击越南河内嘉林日军机场。因云雾遮蔽，“飞虎队”使用计时轰炸法，将炸弹投到了海防以东30多公里处，给予敌军一定杀伤。日本空军为了报复，于23日恢复了对仰光白天的空袭。在23日至28日之间，敌空军共出动6次，每次飞机均在100架之上，而其编队已将战斗机与轰炸机的比率改成3∶1。敌空军的意图十分明显，即借机与“飞虎队”决战，以歼灭我空军力量。在历时6天的空战中，“飞虎队”共击落敌机50架。
4月10日黎明前，日军10架零式飞机飞来畹町上空，向停在机场上的“飞虎队”飞机发起攻击。由于天气条件干扰无线电波，机场在此之前没有收到警报网的报告，“飞虎队”的大部分飞机都分散停放在机场上，根本来不及起飞躲避。日本飞行员一次接一次地来回扫射机场。队员们在地上用冲锋枪还击，但没有打中敌机。日机击中了“飞虎队”的9架飞机，其中8架只是受到了轻微损伤，经过维修后，到中午时又能够起飞作战。下午3点，20架日本零式飞机再次返回畹町，企图再次破坏停放在地面的“飞虎队”飞机。岂料“飞虎队”和英国空军已经预先升空，日机进入伏击圈后便立即展开攻击。经过交火，7架日机被击落。
4月28日，日军27架轰炸机在战斗机的掩护下，袭击中缅边境的垒允机场。机场跑道遭受严重破坏，志愿队的飞机只好去芒市降落，在那里加油和补充弹药。与此同时，陈纳德接到报告：日本战斗机正在袭击腊戍。这是缅甸尚未落入日本人手中的最后一个小镇。于是，陈纳德立即派沃尔森的第三中队从芒市出发前去拦截日机。当志愿队赶到时，日本飞机已经离去。此后不久，地狱天使中队遭遇24架敌机，击落其中半数，己方只被击落飞机两架，无一飞行员伤亡。
从5月2日起中国空军和“飞虎队”连续出动20多次，轰炸和扫射滇缅边界的腊戍、芒市、惠通桥、龙陵等地日军，有效地迟滞了日军的进攻势头。5月3日，日军占领中国云南边境的畹町镇后，长驱直入，于5月5日攻至怒江西岸，准备渡江直取昆明。5月8日，“飞虎队”以8架战斗机挂载重型炸弹袭击了行进在怒江峡谷和山道上的日军。“飞虎队”将重磅炸弹巧妙地投在峡谷上面的山岩上，乱石飞崩，砸得下面的日军血肉横飞，取得了惊人的战果。接着，美机又呼啸而下，机上的6挺机枪喷出6条火蛇，直扑日军的坦克和步兵。日军顿时溃不成军，50辆卡车被击毁，官兵死亡200余人。本来趾高气扬的日军威风扫尽，只得退往龙陵。
6月12日晨，日军派出轰炸机5架、战斗机13架、侦察机1架从广州天河机场出发，袭击桂林机场。中、美航空队根据情报已作好准备，战斗机升空待机。日机到达桂林上空后，立即遭到“飞虎队”的强力围攻。第一轮进攻，“飞虎队”就击落了敌方3架战斗机。日机在“飞虎队”“打了就走”的非正规战术面前难以招架。至战斗结束时，日军11架飞机被击落，其余的逃走，“飞虎队”仅损失2架飞机。志愿队在桂林上空对日本人取得的胜利被当地人民看成是一个奇迹。这是他们第一次目睹日本飞机狼狈逃窜并被击落。
6月22日下午，美国志愿航空队4架战斗机袭击长江白螺矶，向附近江面的日本海军“隅田”号炮舰等船只进行扫射。日军1艘炮艇和3艘小型运输船被击沉，“隅田”号炮舰舰长以下9人丧命，18人负伤。汉口的日本空军司令部获悉这次袭击后，立即派出14架战斗机尾随“飞虎队”到达衡阳基地上空。返航的“飞虎队”当时已油弹将尽，随即向桂林的中国空军求援，中国空军7架飞机前来援救，随即与日机爆发空战。此战，“飞虎队”击落敌机1架、重创1架。
纵观“飞虎队”短暂而辉煌的战斗历程，从1941年12月20日到1942年7月4日的半年时间里，这支曾被许多军事家预测存在不了3星期的小小空中力量，竟进行了大小空战上百次。他们以区区几十架战斗机的实力鏖战在中国、缅甸、泰国、法属印度支那（今越南、老挝、柬埔寨）的广大空域，使日军再也不敢肆无忌惮地轰炸重庆；并配合英国皇家空军为仰光的港口和滇缅公路赢得了两个半月宝贵的畅通时间，使大量的军用物资得以运进中国。
